Rond het midden van de 16e eeuw besloot Cosimo I de' Medici een gebouw te laten bouwen dat de openbare kantoren van het Groothertogdom in één complex zou verenigen.
Zelfs nadat het gebouw werd omgebouwd tot museum, bleef de naam"Ufizi"(kantoor) aan het gebouw verbonden. In 1559 werd het bouwproject toevertrouwd aan Giorgio Vasari, schilder, kunsthistoricus en een van de beste architecten en stedenbouwkundigen van die tijd.
Door alle huizen tussen het Piazza della Signoria en de rivier de Arno te kopen, konden grote stukken grond worden verworven. Het complex omvatte ook de oude kerk van San Piero Schiraggio, waarvan de overblijfselen nog steeds in het gebied te zien zijn.
Er zijn apsissen aan de buitenkant, aan de kant van de Via della Ninna, en binnen in het gebouw.
In 1565 was de fabriek bijna voltooid, tot het punt dat de lange Vasariaanse "gang", die via de Ponte Vecchio over de Arno loopt en de Uffizi met het Palazzo Pitti verbindt, en de luchtgang die, langs de Via della Ninna, naar het Palazzo Vecchio leidt, al waren gebouwd.
Het bouwwerk van Vasari bestaat uit drie vleugels die een groot vierkant omringen met drie rijen portieken.
De portiek komt uit op de Arno met een prachtige en schilderachtige boog aan de achterzijde. De architectuur van het gebouw is geïnspireerd op de traditionele combinatie van wit pleisterwerk en de afwisseling van licht en donker, vol en leeg, en het grijs van de pietra serena. In het Uffizi-gebouw paste Vasari voornamelijk de modules van Michelangelo toe die te vinden zijn in de Laurentiaanse Bibliotheek, ontworpen door Buonarroti in 1524.
Dit model komt inderdaad duidelijk terug in het lange voorplein dat aan de buitenkant het systeem van pietra serena-stenen elementen reproduceert dat Michelangelo voor de Laurentiaanse Bibliotheek had bedacht. Door het Uffizi-complex in een nieuwe, volledig 16e-eeuwse stijl in de middeleeuwse context van het historische centrum van Florence in te passen, wilde Vasari ook het harmonieuze stadsweefsel uit de 13e eeuw niet verstoren en vooral een prachtige scenische opening creëren voor het massieve volume van het Palazzo Vecchio.
Cosimo's opvolger, Francesco I, een fervent liefhebber van wetenschap en kunst, besloot de loggia die het gebouw bekroonde te renoveren om er enkele zalen in te richten voor zijn collecties kunstvoorwerpen, wapens, wetenschappelijke curiositeiten en laboratoria.
In 1580 werd het werk toevertrouwd aan Bernardo Buontalenti, die tegelijkertijd begon met de bouw van het Grand Ducal Theater op de tweede verdieping (waar nu het Kabinet van Tekeningen en Prenten is gevestigd) en de Tribuna op de tweede verdieping, bedoeld om de beste stukken uit de Medici-collectie te huisvesten.
In 1586 was de hele transformatie bijna voltooid. Al snel werden alle werken die verspreid waren over het Palazzo Vecchio en het Palazzo Medici, eigendom van Cosimo de Oude, Lorenzo de Magnifico en Francesco's vader Cosimo I, samengebracht in de nieuwe zalen.
Aan de eerste kern van werken, die al meesterwerken van Sandro Botticelli, Paolo Uccello en Filippo Lippi omvatte, werden in de loop der eeuwen andere schilderijen en sculpturen toegevoegd, dankzij de gepassioneerde belangstelling van de opvolgers van Francesco I. Ferdinand I liet alle werken die hij in Rome in de Villa Medici had verzameld, overbrengen naar de Uffizi.
Ferdinand II plaatste daar in 1631 een zeer belangrijke groep schilderijen, waaronder werken van Piero della Francesca, Titiaan en Rafaël, die door de hertogen van Urbino aan zijn vrouw Vittoria della Rovere waren nagelaten.
In 1675 werd de Uffizi verrijkt met de collectie van kardinaal Leopold de' Medici, die enkele portretten en de eerste kern van de tekeningencollectie omvatte. Cosimo III verzamelde edelstenen, medailles en munten en haalde uit Rome de beroemde Venus, later "dei Medici" genoemd, de Arrotino, de Lottatori en andere opmerkelijke antieke sculpturen.
Anna Maria Lodovica, keurvorstelijk prinses van de Palts en laatste erfgename van de Medici, die de waardevolle collectie al had uitgebreid met Vlaamse en Duitse schilderijen, schonk de hele collectie in haar testament (1743) aan de Toscaanse staat, op voorwaarde dat alle werken in Florence zouden blijven.
De Lorraines zetten de traditie van de Medici voort en droegen ook bij aan de uitbreiding van het artistieke erfgoed van de galerie: Francesco schonk oude sculpturen en munten, terwijl Pietro Leopoldo niet alleen de nog verspreid over Florence en Rome zijnde werken van de Medici herenigde, maar ook de Niobe en Niobidi-groep, waarvoor hij in 1780 een speciale zaal liet bouwen, uit de Villa Medici in Rome liet overbrengen.
Peter Leopold wordt ook gecrediteerd voor het initiatief tot een reorganisatie van de galerie volgens moderne museale criteria en voor het openstellen ervan voor het publiek. In de 19e eeuw, toen in Florence een aantal gespecialiseerde musea werden opgericht (het Archeologisch Museum, het Nationaal Museum Bargello, het San Marco Museum, enz.), verloor het Uffizi een deel van zijn collecties.
Een deel van het gebouw werd in 1852 bestemd voor het Staatsarchief en aan het einde van de eeuw werd het theater gesloopt om plaats te maken voor meer zalen. Tegen het midden van de 19e eeuw onderging de buitenkant van het gebouw enkele veranderingen: er werden nissen aangebracht in de zuilen van de portiek aan het plein en daar werden beelden van beroemde Toscanen geplaatst, gemaakt door beeldhouwers uit die tijd, zoals Giovanni Dupré en Lorenzo Bartolini.
Wat het heden betreft, zijn twee belangrijke initiatieven het vermelden waard: de recente heropening van de Vasarian Corridor, waar werken uit de zeventiende en achttiende eeuw zijn tentoongesteld samen met de opmerkelijke collectie zelfportretten, en de oprichting van een educatief gedeelte dat voornamelijk bedoeld is voor de organisatie van studieprogramma's en rondleidingen voor studenten.