Em meados do século XVI, Cosme I de Médici decidiu construir um edifício que reunisse os escritórios públicos do Grão-Ducado num único complexo.
Mesmo depois de o edifício ter sido convertido em museu, o nome«Ufizi»(escritório) permaneceu no edifício. Em 1559, o projeto de construção foi confiado a Giorgio Vasari, pintor, historiador de arte e um dos melhores arquitetos e urbanistas da época.
Foi possível adquirir grandes terrenos comprando todas as casas entre a Piazza della Signoria e o rio Arno. O complexo também incluía a antiga igreja de San Piero Schiraggio, cujos vestígios ainda hoje se encontram na área.
Existem absides no exterior, no lado da Via della Ninna e no interior do edifício.
Em 1565, a fábrica estava quase concluída, a ponto de já ter sido construído o longo «corredor» vasariano que, atravessando o Arno pela Ponte Vecchio, liga a Galeria Uffizi ao Palácio Pitti, e a passagem aérea que, contornando a Via della Ninna, conduz ao Palazzo Vecchio.
A construção de Vasari consiste em três alas que circundam um grande quadrado com três filas de pórticos.
O pórtico abre-se para o Arno com uma magnífica e pitoresca arcada na parte traseira. A arquitetura do edifício é inspirada na combinação tradicional de reboco branco e na alternância de claro e escuro, cheio e vazio, e no cinzento da pietra serena. No edifício Uffizi, Vasari aplicou principalmente os módulos de Michelangelo encontrados na sala da Biblioteca Laurentiana, projetada por Buonarroti em 1524.
De facto, este modelo é claramente reproduzido no longo pátio que, no exterior, reproduz o sistema de elementos em pedra serena concebido por Michelangelo para a Biblioteca Laurentiana. Ao inserir o complexo dos Uffizi, num estilo novo e totalmente renascentista, no contexto medieval do centro histórico de Florença, Vasari também se preocupou em não perturbar o harmonioso tecido urbano da cidade, que remonta ao século XIII, procurando acima de tudo criar uma maravilhosa abertura cénica para a volumosa massa do Palazzo Vecchio.
O sucessor de Cosme, Francesco I, um estudioso de ciências e artes, decidiu renovar a loggia que coroava o edifício para destinar algumas salas às suas coleções de objetos de arte, armas, curiosidades científicas e laboratórios.
Em 1580, a obra foi confiada a Bernardo Buontalenti, que simultaneamente iniciou a construção do Teatro Granducal no segundo andar (onde hoje se encontra o Gabinete de Desenhos e Gravuras) e da Tribuna no segundo andar, destinada a abrigar as melhores peças da coleção dos Médici.
Em 1586, toda a transformação estava quase concluída. Em pouco tempo, todas as obras que estavam distribuídas entre o Palazzo Vecchio e o Palazzo Medici, pertencentes a Cosme, o Velho, Lorenzo, o Magnífico, e Cosme I, pai de Francesco, foram reunidas nas novas salas.
Ao primeiro núcleo de obras, que já incluía obras-primas de Sandro Botticelli, Paolo Uccello e Filippo Lippi, foram acrescentadas outras pinturas e esculturas ao longo dos séculos, graças ao interesse apaixonado dos sucessores de Francesco I. Fernando I mandou transferir para os Uffizi todas as obras que tinha colecionado em Roma na Villa Medici.
Em 1631, Fernando II colocou ali um importante conjunto de pinturas, incluindo obras de Piero della Francesca, Ticiano e Rafael, obras que tinham sido legadas à sua esposa Vittoria della Rovere pelos duques de Urbino.
Em 1675, a Galeria Uffizi foi enriquecida pela coleção do cardeal Leopoldo de Médici, que incluía alguns retratos e o primeiro núcleo da coleção de desenhos. Cosme III colecionava pedras preciosas, medalhas e moedas e trouxe de Roma a famosa Vénus, mais tarde chamada «dei Medici», o Arrotino, os Lottatori e outras esculturas antigas notáveis.
Anna Maria Lodovica, Eleitora Palatina e última herdeira dos Médici, que já havia ampliado a valiosa coleção com pinturas flamengas e alemãs, doou toda a coleção ao Estado da Toscana em seu testamento (1743), com a condição de que todas as obras permanecessem em Florença.
Os Lorraines, continuando a tradição dos Médici, também contribuíram para aumentar o património artístico da galeria: Francesco doou esculturas e moedas antigas, enquanto Pietro Leopoldo, além de reunir as obras pertencentes aos Médici ainda dispersas entre Florença e Roma, mandou transportar da Villa Medici, em Roma, o grupo Niobe e Niobidi, para o qual mandou construir uma sala especial em 1780.
A Pietro Leopoldo também é atribuída a iniciativa de reorganizar a galeria de acordo com critérios museográficos modernos e de a abrir ao público. No século XIX, quando foram criados vários museus especializados em Florença (o Museu Arqueológico, o Museu Nacional do Bargello, o Museu de San Marco, etc.), os Uffizi perderam parte das suas coleções.
Parte do edifício foi destinada a abrigar os Arquivos do Estado em 1852 e, no final do século, o teatro foi destruído para dar lugar a mais salas. Em meados do século XIX, o exterior do edifício sofreu algumas transformações: foram abertos nichos nas colunas do pórtico da praça, onde foram colocadas estátuas de ilustres toscanos, executadas por escultores da época, como Giovanni Dupré e Lorenzo Bartolini.
Quanto ao presente, duas iniciativas importantes merecem destaque: a recente reabertura do Corredor Vasariano, no qual obras dos séculos XVII e XVIII foram dispostas juntamente com a notável coleção de autorretratos, e a criação de uma seção educativa destinada principalmente à organização de programas de estudo e visitas guiadas para estudantes.