Pada pertengahan abad ke-16, Cosimo I de' Medici memutuskan untuk membangun sebuah gedung yang akan menggabungkan kantor-kantor pemerintahan Grand Duchy dalam satu kompleks.
Bahkan setelah bangunan tersebut diubah menjadi museum, nama"Ufizi"(kantor) tetap melekat pada bangunan tersebut. Pada tahun 1559, proyek pembangunan bangunan tersebut dipercayakan kepada Giorgio Vasari, seorang pelukis, sejarawan seni, dan salah satu arsitek serta perencana kota terbaik pada masanya.
Lahan luas dapat diperoleh dengan membeli semua rumah antara Piazza della Signoria dan Sungai Arno. Kompleks ini juga mencakup gereja kuno San Piero Schiraggio, sisa-sisanya masih berdiri di area tersebut hingga kini.
Ada apse di luar, di sisi Via della Ninna dan di dalam bangunan.
Pada tahun 1565, pabrik tersebut hampir selesai, hingga koridor Vasarian yang panjang, yang melintasi Sungai Arno melalui Ponte Vecchio dan menghubungkan Uffizi dengan Istana Pitti, serta jembatan udara yang melewati Via della Ninna dan masuk ke Palazzo Vecchio, telah dibangun.
Konstruksi Vasari terdiri dari tiga sayap yang mengelilingi sebuah lapangan besar dengan tiga baris portiko.
Portiko tersebut menghadap ke Sungai Arno dengan sebuah lengkungan megah dan indah di bagian belakang. Arsitektur bangunan ini terinspirasi oleh kombinasi tradisional plester putih dan perpaduan antara terang dan gelap, penuh dan kosong, serta warna abu-abu dari batu pietra serena. Di bangunan Uffizi, Vasari terutama menerapkan modul-modul Michelangelo yang ditemukan di ruang Perpustakaan Laurentian, yang dirancang oleh Buonarroti pada tahun 1524.
Memang, model ini jelas terwujud dalam halaman depan yang panjang, yang di bagian luarnya meniru sistem elemen batu pietra serena yang dirancang oleh Michelangelo untuk Perpustakaan Laurentian. Dengan memasukkan kompleks Uffizi, dalam gaya baru dan sepenuhnya abad ke-16, ke dalam konteks medieval pusat sejarah Florence, Vasari juga berupaya tidak mengganggu struktur urban harmonis kota yang berasal dari abad ke-13, dengan tujuan utama menciptakan pembukaan pemandangan yang menakjubkan untuk massa bangunan Palazzo Vecchio.
Cosimo's penerus, Francesco I, seorang penggemar ilmu pengetahuan dan seni, memutuskan untuk merenovasi loggia yang menghiasi bangunan tersebut guna mengalokasikan beberapa ruangan untuk koleksi benda seni, senjata, keajaiban ilmiah, dan laboratoriumnya.
Pada tahun 1580, pekerjaan tersebut diserahkan kepada Bernardo Buontalenti, yang secara bersamaan memulai pembangunan Teater Grand Ducal di lantai dua (di mana kini terletak Kabinet Gambar dan Cetakan) dan Tribuna di lantai dua, yang dirancang untuk menampung karya-karya terbaik dari koleksi Medici.
Pada tahun 1586, transformasi keseluruhan hampir selesai. Segera, semua karya seni yang tersebar di antara Palazzo Vecchio dan Palazzo Medici, milik Cosimo yang Tua, Lorenzo yang Agung, dan ayah Francesco, Cosimo I, dikumpulkan di ruangan-ruangan baru.
Ke inti awal karya-karya tersebut, yang sudah mencakup masterpiece oleh Sandro Botticelli, Paolo Uccello, dan Filippo Lippi, ditambahkan lukisan dan patung lain sepanjang abad-abad berikutnya, berkat minat yang besar dari para penerus Francesco I. Ferdinand I memindahkan semua karya yang dikumpulkannya di Roma di Villa Medici ke Uffizi.
Ferdinand II, pada tahun 1631, menempatkan di sana sekelompok lukisan yang sangat penting, termasuk karya-karya Piero della Francesca, Titian, dan Raphael, yang telah diwariskan kepada istrinya, Vittoria della Rovere, oleh para adipati Urbino.
Pada tahun 1675, Uffizi diperkaya dengan koleksi Kardinal Leopold de' Medici, yang mencakup beberapa potret dan inti awal koleksi gambar. Cosimo III mengumpulkan permata, medali, dan koin, serta membawa dari Roma patung Venus yang terkenal kemudian disebut "dei Medici," Arrotino, Lottatori, dan patung-patung kuno terkenal lainnya.
Anna Maria Lodovica, Putri Palatina dan pewaris terakhir keluarga Medici, yang telah memperluas koleksi berharga dengan lukisan-lukisan Flemish dan Jerman, mewariskan seluruh koleksinya kepada Negara Toscana dalam wasiatnya (1743), dengan syarat semua karya tetap berada di Florence.
Keluarga Lorraine, melanjutkan tradisi Medici, juga berkontribusi dalam meningkatkan warisan seni galeri: Francesco mendonasikan patung-patung kuno dan koin, sementara Pietro Leopoldo, selain mengumpulkan kembali karya-karya Medici yang masih tersebar di Florence dan Roma, memindahkan kelompok patung Niobe dan Niobidi—untuk yang ia bangun ruangan khusus pada tahun 1780—dari Villa Medici di Roma.
Peter Leopold juga diakui sebagai inisiator reorganisasi galeri sesuai dengan kriteria museografi modern dan pembukaannya untuk umum. Pada abad ke-19, ketika sejumlah museum khusus didirikan di Florence (Museum Arkeologi, Museum Nasional Bargello, Museum San Marco, dll.), Uffizi kehilangan sebagian koleksinya.
Sebagian bangunan ditunjuk untuk menampung Arsip Negara pada tahun 1852, dan pada akhir abad tersebut, teater dihancurkan untuk memberi ruang bagi ruangan-ruangan baru. Pada pertengahan abad ke-19, bagian luar bangunan mengalami beberapa perubahan: ceruk-ceruk dibuka di kolom-kolom portiko di alun-alun, dan patung-patung yang menggambarkan tokoh-tokoh terkenal Tuscany ditempatkan di sana, dibuat oleh pemahat-pemahat terkenal seperti Giovanni Dupré dan Lorenzo Bartolini.
Saat ini, ada dua inisiatif penting yang patut disebutkan: pembukaan kembali Koridor Vasarian, di mana karya-karya dari abad ke-17 dan ke-18 ditata bersama koleksi lukisan diri yang luar biasa, serta pembentukan bagian pendidikan yang ditujukan terutama untuk penyelenggaraan program studi dan tur panduan bagi siswa.