De tweede gang verbindt de twee vleugels van het gebouw. Als men uit de grote zijramen kijkt, kan men aan de linkerkant een prachtig uitzicht bewonderen over de wijk Oltrarno van Florence, de heuvels met de witgekalkte gevel van San Miniato, Forte Belvedere en de Arno, die aan de rechterkant wordt overspannen door de Ponte Vecchio.
Aan de andere kant heeft men een uitzonderlijk perspectief op het Uffizi-plein en, op de achtergrond, het Piazza della Signoria met het imposante Palazzo Vecchio. In het eerste deel is het plafond van de gang versierd met een prachtige 17e-eeuwse prieeldecoratie. Net als in de eerste gang zijn hier een aantal waardevolle klassieke sculpturen te vinden.
Bijzonder opmerkelijk zijn een cirkelvormig altaar, versierd met een bas-reliëf met het offer van Iphigenia, een voorbeeld van neo-Attische kunst uit de 1e eeuw v.Chr.; de Spinarius, een Romeinse kopie van een Grieks bronzen origineel uit de 2e-1e eeuw v.Chr.; de Venus in het bad, een kopie van een Grieks origineel van Doidalsas, uit de 3e eeuw v.Chr.; de prachtige Zittende maagd die zich klaarmaakt om te dansen, een kopie van een Hellenistisch origineel uit de 3e eeuw v.Chr.; en twee figuren van Romeinse dames die luieren.