De ingang bevindt zich in de derde gang, tussen kamer 25 en kamer 34. De gang, die de Arno overspant via de Ponte Vecchio en het Uffizi en het Palazzo Vecchio met het Palazzo Pitti verbindt, werd door Cosimo I de' Medici aan Vasari opgedragen en in zeer korte tijd, vijf maanden, voltooid in 1565.
Het liep tijdens de Tweede Wereldoorlog ernstige schade op en kon pas in 1973 weer voor het publiek worden geopend. De route is bijna een kilometer lang en de ramen en "ogen" die langs het pad openen, bieden bezoekers een indrukwekkend uitzicht op de stad, de rivier en de Ponte Vecchio. Eén raam, dat onlangs opnieuw is geopend, kijkt uit op het interieur van de kerk van Santa Felicita, aan de Oltrarno, en het lijkt erop dat de groothertogen vanaf datzelfde uitkijkpunt de mis bijwoonden.
In de Vasariaanse gang zijn talrijke werken uit de zeventiende en achttiende eeuwte zien. In de eerste zalen hangen opmerkelijke schilderijen van Caravaggio-schilderaars, waaronder Gherardo delle Notti met Het geluk, Toast in Olympus en Avondmaal met luitspeler; Rutilio Manetti, Francesco Rustici met Schilderkunst en architectuur; Artemisia Gentileschi met Judith en Holofernes; en Guido Reni.
Daarna volgen werken van 17e-eeuwse Italiaanse schilders, van Annibale Carracci tot Guido Reni met zijn Slapende Endymion. Een lange gang herbergt 17e-eeuwse Italiaanse schilderijen, ingedeeld per stad, waaronder Giovan Battista Crespi's Heilige conversatie, Guercino's Sybil Samia en een Portret van kardinaal Agucchia door Domenichino. Er zijn ook werken van de Napolitaanse school, waaronder Salvator Rosa, Battistello Caracciolo, Cerquozzi en Giuseppe Recco met een van zijn stillevens, de prachtige Fair of Poggio a Caiano van Giuseppe Maria Crespi, putti in volo van Giovan Battista Tiepolo en tot slot enkele doeken van Rosalba Carriera en Pompeo Batoni.
Het beroemdste deel van de Vasari-gang is gewijd aan de buitengewone collectie zelfportretten uit alle tijdperken, zowel Italiaanse als buitenlandse. Onder de Italianen bevinden zich die van Leonardo, Vasari, Agnolo, Taddeo en Gaddo Gaddi, Romanino, Andrea del Sarto, Bronzino, Titiaan, Jacopo Bassano, Palma il Giovane, Veronese en vele anderen. De route wordt afgesloten met een iconografische collectie met portretten van beroemde personen uit verschillende tijdperken.