L'entrée se trouve dans le troisième couloir, entre la salle 25 et la salle 34. Le couloir, qui enjambe l'Arno par le Ponte Vecchio et relie les Offices et le Palazzo Vecchio au Palazzo Pitti, a été commandé à Vasari par Cosme Ier de Médicis et achevé en très peu de temps, cinq mois, en 1565.
Il a subi de graves dommages pendant la Seconde Guerre mondiale et n'a pu être rouvert au public qu'en 1973. Le parcours s'étend sur près d'un kilomètre et les fenêtres et « yeux » qui s'ouvrent le long du chemin offrent aux visiteurs des vues évocatrices sur la ville, le fleuve et le Ponte Vecchio. Une fenêtre, récemment rouverte, donne sur l'intérieur de l'église Santa Felicita, dans l'Oltrarno, et il semble que c'est depuis ce même point de vue que les grands-ducs assistaient à la messe.
Le couloir de Vasari abrite de nombreuses œuvres des XVIIe et XVIIIe siècles. Les premières salles présentent des peintures remarquables de peintres caravagiens, notamment Gherardo delle Notti avec La Bonne Fortune, Le Toast dans l'Olympe et Le Souper avec le joueur de luth ; Rutilio Manetti, Francesco Rustici avec Peinture et Architecture ; Artemisia Gentileschi avec Judith et Holopherne ; et Guido Reni.
Viennent ensuite les œuvres de peintres italiens du XVIIe siècle, d'Annibale Carracci à Guido Reni avec son Endymion endormi. Un long couloir abrite des peintures italiennes du XVIIe siècle, classées par ville, parmi lesquelles La Conversation sacrée de Giovan Battista Crespi, La Sibylle Samia du Guerchin et un Portrait du cardinal Agucchia de Domenichino. On trouve également des œuvres de l'école napolitaine, notamment Salvator Rosa, Battistello Caracciolo, Cerquozzi et Giuseppe Recco avec l'une de ses natures mortes, la splendide Foire de Poggio a Caiano de Giuseppe Maria Crespi, les putti in volo de Giovan Battista Tiepolo, et enfin quelques toiles de Rosalba Carriera et Pompeo Batoni.
La partie la plus célèbre du couloir de Vasari est celle consacrée à l'extraordinaire collection d'autoportraits de toutes les époques, tant italiens qu'étrangers. Parmi les Italiens, on trouve ceux de Léonard de Vinci, Vasari, Agnolo, Taddeo et Gaddo Gaddi, Romanino, Andrea del Sarto, Bronzino, Titien, Jacopo Bassano, Palma il Giovane, Véronèse et bien d'autres. L'itinéraire se termine par une collection iconographique de portraits de personnages célèbres de différentes époques.